卡梅德生物科技（天津）有限公司
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卡梅德生物（KMD Bioscience）多年致力于重組蛋白表達與制備研究。我們的科學家擁有豐富的原核蛋白表達以及工業級別蛋白發酵、純化經驗。通過每年多達400個原核蛋白制備項目的技術積累，卡梅德生物（KMD Bioscience）設計了一套有效的包含多種融合標簽（His，GST，SUMO，FLAG等標簽）的表達載體，能夠為客戶可溶性表達超過150kDa分子量的重組蛋白；同時我們收集與建立了多種表達菌株（包括低溫誘導表達菌株，10-16℃超低溫誘導表達蛋白），以保證每一個重組蛋白制備的品質，為客戶提供優質的服務。
大腸桿菌（E. coli）重組蛋白表達技術經過多年的發展，已經變得日趨成熟。但想要在大腸桿菌表達體系獲得較高水平的可溶性以及高產量的蛋白表達，尤其是針對大分子蛋白和某些藥物類蛋白，一個優質的表達策略必不可少?？蛻糁恍枰峁┪覀円欢蔚鞍仔蛄?，CDS或蛋白名稱，我們富有經驗的科學家均可以為您在較短的時間內制定一個完整的蛋白表達和純化方案。常見的小分子（分子量<10 kDa）蛋白類藥物，如Leptin，利拉魯肽，EGF等在原核表達過程中以親和標簽+融合蛋白形式進行表達，發酵和純化。此類蛋白的難點在于蛋白均以包涵體的形式進行表達，后期需要進行工藝繁瑣的蛋白變復性處理。
重組蛋白的高效率表達，通常會涉及以下幾個方面：
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宿主體系選擇：
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蛋白需求不同，那么表達宿主體系也不盡相同。原核表達體系常用的宿主為大腸桿菌和枯草桿菌，前者表達量高，后期產品需要去除內毒素；后者蛋白產量相對較低，但不產生內毒素。重組蛋白大腸桿菌表達常采用BL21（DE3）和K-12衍生菌株作為表達宿主與枯草桿菌作為表達菌株的主要區別如下所示：
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項目 |
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優點 |
* 應用廣泛，操作簡單，大規模生產成本低廉 |
* 生產成本低廉，不產內毒素，能夠分泌表達蛋白 |
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缺點 |
* 分泌能力差 |
* 產量相對較低 |
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常用宿主 |
* Rosetta (DE3)，Rosetta(DE3)pLysS，Rosetta 2(DE3)pLysS，Origami 2(DE3)，Rosetta-gami 2(DE3)pLysS |
* WB600，WB800N，Bacillus Subtilis 168 |
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表達質粒體系選擇：
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目前常用的重組蛋白表達質粒載體融合了復制子(Replicon)、啟動子(promoter)、篩選標簽(selection marker) 、多克隆位點（MCS）和融合蛋白移除策略(fusion tag removal strategy) ，如圖所示：
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卡梅德生物的科學家通過改造pET載體，獲得雙表達質粒（BiPlasmid vector），該質粒含有雙MCS位點，雙T7啟動子，雙lac操縱子和雙核糖體結合位點，利用該質粒我們可以為客戶進行一次轉染操作，而獲得兩種蛋白的獨立表達。同時我們構建了含有低溫誘導蛋白表達元件的pCold系列載體，該載體能夠在16℃條件下經過IPTG誘導表達大分子量蛋白，如上清表達150kDa活性蛋白。
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融合標簽選擇：
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親和標簽：蛋白重組表達過程中采用親和標簽融合表達有兩方面的作用：一方面是為了使蛋白純化過程變得更加容易；另一方面是為了促進某些不溶性蛋白可溶。蛋白標簽可分兩類：一類是短肽類標簽；一類是長肽以融合蛋白（fused partner）形式共表達。使用不同的蛋白標簽需要根據具體案例來分析，卡梅德生物總結了常用的一些蛋白標簽性質，如表1所示。
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表1 蛋白標簽主要特征 |
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肽標簽 |
殘基/MW（kDa) |
配體/基質 |
純化條件 |
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Poly-Arg |
~5/0.80 |
陽離子交換樹脂 |
NaCl線性洗脫(0–400 mM) |
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Poly-His |
~6/0.84 |
Ni2+瓊脂柱 |
20–250 mM咪唑/低pH |
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FLAG |
8/1.01 |
FLAG抗體親和瓊脂柱 |
2–5 mM EDTA |
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Strep-tag II |
8/1.06 |
鏈親和素 |
2–25 mM脫硫生物素 |
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c-myc |
11/1.20 |
myc抗體親和瓊脂柱 |
低pH |
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S-tag |
15/1.75 |
S蛋白瓊脂柱 |
3 M異硫氰酸; 0.2 M檸檬酸鉀, pH 2或3 M MgCl2 |
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融合伴侶蛋白 |
Ca. (計算分子量) |
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Fh8 |
69/8.0 |
Ca2+ 依賴性苯基瓊脂糖凝膠 |
10 mM EDTA |
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Trx |
109/11.7 |
4氨基氧化苯胂瓊脂凝膠柱 |
5–1000mM 2-巰基乙醇 |
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SUMO |
ca. 100/12.0 |
親和標簽純化（His） |
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BRT17 (β roll tag) |
153/14.7 |
? |
25–75 mM Ca2+溶液沉淀 |
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GST |
211/26.0 |
谷胱甘肽瓊脂柱 |
10–20 mM還原谷胱甘肽 |
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HaloTag7 |
ca. 300/34.0 |
氯烷烴配體瓊脂柱 |
帶標簽掛柱蛋白酶裂解 |
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MBP |
396/ca. 42.5 |
交聯支鏈淀粉 |
10 mM麥芽糖 |
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ELPs |
550/ca.47.0 |
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高濃度NaCl (>1.5 M)或溫度轉變方式 |
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NusA |
495/54.8 |
親和標簽純化（His） |
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蛋白重組表達策略組合：
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重組蛋白的表達往往不像理論那樣一帆風順，在實際的表達過程中有可能產生各種各樣的問題。在選擇一個蛋白表達策略困難的情況下，那么采用看似笨拙的方法，有可能會成為一種意想不到的“成功捷徑”，比如項目要求構建表達兩種重組蛋白時，構建6種不同的表達質粒，意味著有36種不同的表達條件組合，通過高通量微量蛋白表達實驗一次性就可獲得蛋白表達條件組合，后續中式飛行試驗和成本控制會變得相對容易。
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蛋白原核重組表達服務具體流程：
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服務優勢：
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--密碼子優化：包含稀有密碼子分析，蛋白親水性分析和跨膜結構域的預測分析
--多種融合標簽載體和宿主，以保證高可溶蛋白表達和高蛋白活性
--多種規模蛋白發酵模式：小規模（1L，10L和30L）、大規模（80L，130L，250L和500L發酵罐）
--短時間內制備高純度毫克級，克級重組蛋白
--低內毒素：LAL檢測法<0.1EU/ug
--完整的GMP文件支撐體系，保證您的產品所有材料、試劑和制備信息可追溯
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